細胞骨架染色試劑盒采用絲狀肌動蛋白F-actin熒光染色法染色細胞骨架，可以用于各種動物、植物的細胞骨架染色。本試劑盒采用熒光探針TRITC(Rhodamine，羅丹明，Tetramethylrhodamine Isothiocyanate)標記的鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)來標記骨架蛋白F-actin。TRITC為橙紅色熒光探針。...

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● PBS緩沖液 ● 固定液4%多聚甲醛 ● 透化液0.05-0.1% Triton X-100(溶于PBS) ● 100 nM DAPI溶液 ● 蓋玻片周圍密封液(如透明指甲油) ● 純水 ● 載玻片和蓋玻片

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體損失。

● 標本應新鮮，且未受其他化學物品污染。

● 應根據(jù)組織、細胞類型不同調整通透時間。

● 動物細胞樣本細胞通透劑處理的時間很關鍵，如果處理時間太短，會造成很深的背景顏色，干擾細胞骨架的觀察；如果處理時間太長，會破壞骨架蛋白使骨架纖維斷裂，造成細胞空洞。通透時間應控制在10-35分鐘。需要根據(jù)預實驗的染色結果確定最佳通透時間。一般預實驗起始通透時間植物樣本為10分鐘，動物細胞樣本5分鐘。

● 染色液染色時間根據(jù)預實驗結果可以進行調整，顏色過淺可延長染色時間，顏色過深可縮短染色時間。

● 洗片時動作要輕柔，避免將細胞從玻片上洗掉。

● 染色后用水充分洗滌，自然晾干即可，不能用常規(guī)的酒精梯度脫水方法。

● 不同樣本的操作方法稍有差異，請根據(jù)具體樣本操作。

● 下面以細胞爬片/涂片樣本的染色為例，滴加相應的試劑到玻片上，加樣量以覆蓋樣本即可。如果是植物切片等，也可以在離心管、試管等里面進行洗滌、通透、染色等操作，最后置載玻片上觀察即可。

使用方法：

1. 染色工作液配制：

根據(jù)樣本數(shù)量，用染料稀釋液將TRITC-Phalloidin熒光染料10倍稀釋。

再用相應的無血清培養(yǎng)基或其他緩沖液(如HBSS、PBS等)將熒光染料進行10倍稀釋，配制成染色工作液。

【注】：

● 也可以不使用本試劑盒中的試劑B，直接用相應的培養(yǎng)基或HBSS等緩沖液稀釋染料至所需濃度。

● 開始實驗前，使用培養(yǎng)基或HBSS緩沖液稀釋染料儲存液到需要的工作濃度。工作濃度應根據(jù)不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度，建議至少在超過10 倍范圍的濃度下進行測試。一般染色終濃度50-150 倍稀釋，100倍適合大多數(shù)細胞樣本。

● 工作濃度為根據(jù)不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度。起始測試工作濃度可以用100倍稀釋。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

● 建議收到產品后，根據(jù)單次使用量，對母液進行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

2. 將制作好的細胞爬片/細胞涂片用37℃預熱的1×PBS(pH 7.4)清洗2次。

3. 細胞固定：滴加溶于PBS的4%甲醛溶液進行細胞固定，室溫固定5-10分鐘，立即用PBS洗滌3-5次。

【注】：

● 避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。

● 樣本多時可用容器裝好PBS分別浸泡洗滌3-5次，樣本較少時也可以加500μL PBS到玻片上進行洗滌。

● 此步驟為動物細胞樣本的步驟，植物切片類不需要做此步驟，第2步洗滌完直接進行第4步通透即可。

4. 室溫條件下，透化細胞：滴加0.05-0.1% Triton X-100/PBS溶液透化處理樣本，處理3-5分鐘。

【注】：

● 經Triton破膜過度后，TRITC-Phalloidin可能對細胞核有非特異性染色，注意通透時間。

● 該步驟可以省略，因為TRITC-Phalloidin分子量比較小，多聚甲醛固定后細胞膜產生的部分孔洞可以讓TRITC-Phalloidin進入細胞。

5. 室溫條件下，用PBS洗細胞3-5次，自然晾干。

6. 室溫條件下，染色：用適量細胞骨架染色液工作液，覆蓋住玻片上的細胞，室溫避光孵育40分鐘-更長時間，最長可以過夜染色，一般40分鐘-1小時即可。

【注】：

● 可以在染色工作液內加入終濃度為1% BSA，能起到降低背景的作用；

● 或者在染色前用含1% BSA的PBS液室溫封閉細胞20-30分鐘。

● 孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可將玻片轉移到一個密封的容器內。

7. 用PBS洗細胞3次，每次5分鐘。自然晾干。

8. 使用適量濃度為100nM的DAPI溶液對細胞核進行復染，約30 秒即可。

【注】：

● 此步驟為選做步驟，可以不進行核復染。

● 也可以根據(jù)需要選擇其它顏色的核染料。

9. 用PBS洗細胞。

10. 用激光共聚焦顯微鏡觀察。TRITC-Phalloidin激發(fā)/發(fā)射波長540-545/565-595nm和DAPI激發(fā)/發(fā)射波長359-364/454-461nm。

【注】：

● 或封片后觀察。

● 標本玻片可置于4℃避光保存，通常6個月內可繼續(xù)做染色分析。

染色結果：

細胞骨架纖維呈橙紅色。細胞核呈藍色(如果DAPI復染)。

細胞核和細胞質表面分布許多排列不規(guī)則的纖維束，走向清晰。

【注】：

● 如果見到部分細胞骨架纖維并非呈纖維狀，而是呈串珠狀或顆粒狀，可以進一步優(yōu)化通透、染色時間、染液濃度等條件。

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