標(biāo)簽：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 古朵生物 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基

  人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的具體方法是？

  臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)：

  1. 將 15-20cm 長(zhǎng)的新生兒臍帶放入無菌的 PBS 溶液中儲(chǔ)存。(注：4℃下多貯存 24 小時(shí)，室溫下不超過 6 小時(shí)，否則廢棄)

  2. 用一個(gè)鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗 3-5 次，將污血沖洗干凈為止。

  3. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入 15ml 的膠原酶(1mg/ml)室溫下消化 15-20分鐘，并不時(shí)上下?lián)u動(dòng)臍帶。

  4. 消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個(gè) 50 ml 無菌離心管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗臍帶 2-3 次。

  5. 將收集液離心(2000 轉(zhuǎn)/ 分)3 分鐘。

  6. 倒去上清，加入 10ml M199 培養(yǎng)基(加入 10U/ml 的 bFGF) ，用彎管吹散細(xì) 胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個(gè)用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。(注：每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入 3- 4ml 無菌的 1%的明膠溶液，搖勻使得明膠溶液完全 鋪滿瓶底，放入 37℃孵育，少 2 小時(shí)，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被 有利于細(xì)胞貼壁。 )

  7. 培養(yǎng) 24 小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次，洗掉紅細(xì) 胞和死細(xì)胞，加入 10 ml 新鮮的 M199 培養(yǎng)基。

  8. 以后每 2 天換一次培養(yǎng)基(每次換掉 2/3 的培養(yǎng)基) 。

  9. 一般培養(yǎng) 5-7 天，細(xì)胞可長(zhǎng)滿至 80-90%單層，這時(shí)可以傳代。

  10. 倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS 溶液清洗 2-3 次，加入2- 3ml 消化液(0.25%胰/酶+0.1%EDTA)消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

  11. 用彎管將細(xì)胞吹打下來，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè) 50 ml 無菌離心管中，2000 轉(zhuǎn)/ 分，離心 3 分鐘。

  12. 倒掉上清，加入 10ml新鮮培基，一般一瓶細(xì)胞可傳代 3-4 瓶，以后照此傳代培養(yǎng)。

  13. 一般傳代 2-3 代(培養(yǎng)了 20 天左右)用于做各種實(shí)驗(yàn)效果較好。