古朵實(shí)驗(yàn)干貨—Western Blot原理、顯色分類及主要試劑

  (1) 原理

  與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯/酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針"是抗體，“顯色"用標(biāo)記的二抗。

  經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。

  以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

  (2) 分類

  western顯色的方法主要有以下幾種：

  i.放射自顯影

  ii.底物化學(xué)發(fā)光ECL

  iii.底物熒光ECF

  iv.底物DAB呈色

  現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下(二抗用HRP標(biāo)記)：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

  (3) 主要試劑

  1、丙烯/酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯/酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀/酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀/酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯/酰胺儲存液丙稀/酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀/酰胺1g，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。

  2、十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。

  3、分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。

  4、濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。

  5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙2胺催化過硫/酸銨形成自由基而加速兩種丙稀/酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀/酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.

  6、SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lán)1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。

  7、Tris-甘/氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘/氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘/氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。

  8、轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘/氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。

  9、麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯yi酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時(shí)上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。

  10、脫脂奶粉5%(w/v)。

  11、NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。

  12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。

  13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

  14、過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。

  15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

  16、BCIP(溶于二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

  17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。

  18、100mmol/L NaCl。

  19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。

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