正確規(guī)范的ELISA測(cè)定操作方法

  一、臨床標(biāo)本的收集和保存

  用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本zui為常用的是血清(漿)，有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測(cè)目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本?，F(xiàn)在臨床上運(yùn)用血清標(biāo)本測(cè)定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和治療藥物等。對(duì)用于激素和治療藥物測(cè)定的血清標(biāo)本的收集，要留心收集時(shí)間甚或體位有可能會(huì)對(duì)測(cè)定作用發(fā)作影響。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會(huì)有一峰值出現(xiàn)：生長(zhǎng)激素、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發(fā)性辦法開釋，因此，在測(cè)定此類激素時(shí)，有必要在接近相連的時(shí)間距離內(nèi)采用數(shù)份血樣本，以其中心值為測(cè)定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí)，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測(cè)，應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的zui適時(shí)間抽血檢測(cè)。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測(cè)的血清標(biāo)本的收集則沒有時(shí)間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：

  (1)要留心避免出現(xiàn)嚴(yán)峻溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為符號(hào)酶的ELISA測(cè)定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很簡(jiǎn)單在溫育進(jìn)程中吸附于固相，然后與后邊參與的HRP底物反應(yīng)顯色。

  (2)樣本的收集及血清分別中要留心盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長(zhǎng)，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白發(fā)作分解作用;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作符號(hào)的測(cè)定辦法發(fā)作非特異性攪擾。

  (3)血清標(biāo)本如是以無菌操作分別，則能夠在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則主張冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在-70℃以下。

  (4)冰凍保存的血清標(biāo)本須留心避免因停電等形成的重復(fù)凍融。標(biāo)本的重復(fù)凍融所發(fā)作的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子發(fā)作損壞作用，然后引起假陰性作用。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)留心，不要進(jìn)行劇烈振蕩，重復(fù)倒置混勻即可。

  (5)標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所形成的的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心堆積后取上清檢測(cè)。

  二、試劑準(zhǔn)備

  在臨床實(shí)驗(yàn)室，對(duì)試劑準(zhǔn)備一般不太留心，一般的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后邊溫育時(shí)間不可的問題，其直接的后果是對(duì)一些弱陽性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備zui為要害的是，在實(shí)驗(yàn)開端前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在運(yùn)用前與室溫平衡。這樣做的目的，首要是為了在后邊的溫育反應(yīng)進(jìn)程中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地抵達(dá)所要求的高度，以滿足測(cè)定要求。其次，現(xiàn)在的產(chǎn)品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用時(shí)對(duì)所供給的濃縮液稀釋制造，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時(shí)，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前暫時(shí)制造。

  三、加血清樣本及反應(yīng)試劑 本

  在現(xiàn)在的ELISA產(chǎn)品試劑盒中，血清樣本的參與幾乎是僅有的要運(yùn)用微量加樣器參與樣本的進(jìn)程。運(yùn)用微量加樣器加樣有必要留心的要害點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺起和發(fā)作氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺起會(huì)對(duì)附近孔發(fā)作污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的參與在國(guó)產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要留心滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很簡(jiǎn)單出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，然后引起非特異顯色。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的差錯(cuò)所形成的。

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