大家經(jīng)常談起熒光PCR分析參數(shù)設(shè)置與結(jié)果的關(guān)系、乙肝低值質(zhì)控品濃度的選擇及依據(jù)，質(zhì)控品CV值的確定等問(wèn)題。這些問(wèn)題多是大家熟悉但并沒(méi)有深究，在日常工作中多沒(méi)有合理使用，今天和大家討論如下，希望對(duì)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量提升有所幫助。
    基線起點(diǎn)和終點(diǎn)的選擇
    基線（Baseline）是指在PCR擴(kuò)增的初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，這樣的直線即為基線。不同熒光PCR試劑盒由于其敏感性不同，基線起點(diǎn)和終點(diǎn)的設(shè)置也不同。對(duì)于性能的熒光PCR試劑盒，只需要確定基線的終點(diǎn)，即在早PCR擴(kuò)增曲線起點(diǎn)前一個(gè)循環(huán)作為終點(diǎn)，起點(diǎn)在終點(diǎn)前間隔一個(gè)以上的循環(huán)選擇即可，這樣的分析結(jié)果是穩(wěn)定的。由于PCR干擾物質(zhì)的影響或試劑盒抗干擾性能的差異，有的試劑盒擴(kuò)增曲線，在S型擴(kuò)增前出現(xiàn)曲線下陷或曲線上揚(yáng)的情況。這時(shí)需要對(duì)該樣本曲線進(jìn)行個(gè)性化分析，或?qū)υ摌颖局匦聶z測(cè)。基線的選擇常常與其它分析參數(shù)具有聯(lián)動(dòng)性，不同PCR擴(kuò)增儀的基線確定也有不同。
    熒光閾值的選擇
    熒光閾值應(yīng)設(shè)在PCR指數(shù)擴(kuò)增的起始，并高于陰性對(duì)照曲線。其數(shù)值選擇與試劑盒的性能有關(guān)，對(duì)熒光強(qiáng)度較高的擴(kuò)增曲線，閾值的設(shè)定不一定非要遵循固定的原則，基線確定后，閾值幾乎可以隨機(jī)選擇或直接使用儀器默認(rèn)的閾值；如果試劑盒的熒光擴(kuò)增強(qiáng)度較弱，出現(xiàn)核酸含量較低的樣本擴(kuò)增曲線熒光值較低，這時(shí)閾值的選擇對(duì)低值樣本的定量結(jié)果影響較大（下圖）。因此，針對(duì)試劑盒性能不同，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的閾值范圍，盡可能保證低值樣本檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。
    斜率
    試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線一般由4個(gè)間隔10倍或100倍梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品擬合而成。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是由企業(yè)參考品或參考品定值溯源而來(lái)，標(biāo)準(zhǔn)品的理論檢測(cè)值和實(shí)際檢測(cè)值進(jìn)行線性擬合，其理論斜率是3.32，但實(shí)際工作中，試劑盒的實(shí)際斜率經(jīng)常出現(xiàn)高于3.32或低于3.32的情況。
    主要有以下兩個(gè)原因：
    （1）PCR試劑的擴(kuò)增效率不是（偏高或偏低），通常情況是擴(kuò)增效率低于，常見(jiàn)的原因是酶的活性不足、引物探針欠合理或反應(yīng)液非佳條件，導(dǎo)致實(shí)際擴(kuò)增CT值比理論值滯后，這時(shí)斜率會(huì)大于3.32。
    （2）試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品溯源定值不準(zhǔn)確。4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的賦值是按照10倍或100倍的理論值確定，但實(shí)際配制濃度存在逐漸偏高或偏低的情況，或標(biāo)準(zhǔn)品在保存過(guò)程中出現(xiàn)不均一的降解，出現(xiàn)本來(lái)按照10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)際測(cè)定值似乎是按照11倍進(jìn)行稀釋的情況。當(dāng)然也存在按照9倍稀釋的斜率。
    在實(shí)際工作中，斜率發(fā)生偏倚，
    是否需要調(diào)整？調(diào)整的標(biāo)準(zhǔn)是什么？
    先要判斷斜率偏倚的原因，對(duì)準(zhǔn)確進(jìn)行10倍稀釋的核酸或陽(yáng)性樣本，采用性能確定的試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，如果實(shí)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的斜率大于3.32，說(shuō)明試劑盒的擴(kuò)增效率低于，如果斜率超過(guò)3.6，說(shuō)明試劑盒的質(zhì)量存在問(wèn)題，理應(yīng)換，此時(shí)進(jìn)行斜率調(diào)整并不能解決問(wèn)題。
    如果是因操作誤差或試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品降解等因素導(dǎo)致的斜率偏倚，可以參照實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控品進(jìn)行個(gè)別調(diào)整，如果斜率能控制在3.20~3.6之間，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果的變化不會(huì)對(duì)臨床報(bào)告的準(zhǔn)確性產(chǎn)生明顯影響。因操作不當(dāng)導(dǎo)致斜率偏倚，在結(jié)果分析中調(diào)整斜率，是十分必要的事情，但要依據(jù)明確，不能一概而論全部進(jìn)行調(diào)整。
    斜率低于3.0或高于3.6均導(dǎo)致高濃度和低濃度樣本的報(bào)告值發(fā)生較大偏斜。因此，使用斜率控制檢測(cè)質(zhì)量，是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)重視的方面。
    擴(kuò)增效率的計(jì)算
    經(jīng)常我們看到有的PCR擴(kuò)增儀器有擴(kuò)增效率的參數(shù)，但在實(shí)際工作中大多不為人知或去科學(xué)使用。我們知道，PCR的原理是指數(shù)擴(kuò)增，每擴(kuò)增一個(gè)循環(huán)，核酸的量增加一倍，即呈2的n次方,熒光曲線之間的間距由等式“2的n次方=稀釋倍數(shù)”決定。
    這里的n是標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的CT值，如果標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的稀釋倍數(shù)是10倍，那么2的n次方=10，因此n=3.32，即10倍稀釋的PCR擴(kuò)增效率理論值為間隔3.32個(gè)CT值，也是4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品形成的斜率值。
    有的PCR擴(kuò)增儀用百分率表示擴(kuò)增效率，即每個(gè)循環(huán)有效擴(kuò)增模板的百分率，擴(kuò)增效率%=（E-1）×，理想的擴(kuò)增效率是：擴(kuò)增效率（%）=（2-1）×=。
    例如，如果標(biāo)準(zhǔn)品的斜率是3.5，那么E=10的(1/-3.5)次方=1.931, 擴(kuò)增效率（%）=（1.931-1）×=93.1%，每個(gè)循環(huán)的終點(diǎn)，擴(kuò)增子的拷貝數(shù)每個(gè)循環(huán)增加1.931倍，或93.1%的模板被擴(kuò)增。
    擴(kuò)增效率的應(yīng)用
    擴(kuò)增效率超越90~105%范圍的影響因素有許多，如果擴(kuò)增效率下降，常見(jiàn)原因是擴(kuò)增試劑盒里的引物和探針設(shè)計(jì)不當(dāng)，導(dǎo)致與模板的匹配效率較低。實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常采用這種方式檢驗(yàn)所用試劑盒的質(zhì)量。如果檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率超過(guò)，很可能是標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)存在問(wèn)題，即本應(yīng)10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)際進(jìn)行了不足10倍的稀釋?zhuān)?dāng)然也存在標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性較差的情況，這都將導(dǎo)致低值樣本的假性升高。
    關(guān)于室內(nèi)質(zhì)控品的選擇及CV值
    室內(nèi)質(zhì)控是評(píng)價(jià)或發(fā)現(xiàn)一個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)穩(wěn)定性的主要方式，質(zhì)控品可以來(lái)自購(gòu)買(mǎi)商品，也可以自行制作，但都應(yīng)確定自身穩(wěn)定性是否良好。稀釋介質(zhì)決定了質(zhì)控品的穩(wěn)定性，這是讓許多企業(yè)和實(shí)驗(yàn)室頭疼的問(wèn)題，其實(shí)無(wú)論DNA樣本還是RNA樣本，配制一個(gè)穩(wěn)定性良好的介質(zhì)并不困難。
    還有質(zhì)控品的數(shù)量和濃度的擇，無(wú)論是否有文件規(guī)定，選擇一個(gè)低值樣本進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控是完全科學(xué)可行的，因?yàn)橹?、高濃度的室?nèi)質(zhì)控品，尤其是高于試劑盒定量限3個(gè)數(shù)量級(jí)以上的室內(nèi)質(zhì)控品，對(duì)質(zhì)量控制幾乎沒(méi)有任何意義。
    低值室內(nèi)質(zhì)控品的濃度可以根據(jù)試劑盒的定量限來(lái)確定，對(duì)自信度比較高的實(shí)驗(yàn)室，完全可以選擇試劑盒定量限10倍的樣本作為室內(nèi)質(zhì)控品，也可以采用定量限20倍的樣本。例如，如果試劑盒的定量限為20IU/mL, 質(zhì)控品的濃度選擇為200 IU/mL~400 IU/mL。至于CV值，自然應(yīng)該符合<5%的要求。

                                                                             （本文內(nèi)容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系刪除）