材料：

PBS溶液，0.9%生理鹽水, DMEM，

器材：

剪刀，燒杯，保溫瓶，

原代細胞的取材 

一、取材的基本要求

（1）取材要注意新鮮和保鮮  新鮮組織易于培養(yǎng)成功，取材時應(yīng)盡量在4~6h內(nèi)能制作成細胞，盡快入箱培養(yǎng)，若不能即時培養(yǎng)，應(yīng)將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，于4℃存放。若組織塊較大，應(yīng)在清除表面血塊、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織后，切碎于培養(yǎng)液內(nèi)4℃存放，但時間不能超過24h。對于已切碎的組織或血液、淋巴組織應(yīng)加入含10%二甲基亞砜 (DMSO) 的培養(yǎng)基，按細胞凍存方式于液氮中冷凍保存。

（2）取材應(yīng)嚴格無菌  所取標本材料應(yīng)在無菌條件下進行，為了確保無菌，對所取材料若疑有污染的可能，應(yīng)將所取組織在含高濃度抗菌素（400單位/mL）甚至加入適量的兩性霉素B或10%達克寧液的培養(yǎng)液內(nèi)于4℃下存放2小時以上，再用PBS洗2~3次，以確保所取材料無菌。要用無菌包裝的器皿或事先消毒好的帶少許培養(yǎng)液（內(nèi)含400單位/mL抗菌素）的小瓶等便于攜帶的物品來取材，所取材料應(yīng)避免接觸有毒有害的化學物質(zhì)，如碘、汞等。

（3）取材和原代細胞制作時，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細胞的機械損傷。

（4）要仔細去除所取材料上的血液（血塊）、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進行。

（5）取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進行培養(yǎng)。

（6）原代細胞取材時要同時留好組織學標本和電鏡標本。對組織的來源、部位、包括供體的一般情況要做詳細的記錄，以備以后查詢。

原代細胞的分離和制作 

人或動物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細胞結(jié)合緊密，不利于各個細胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長，若需獲取大量細胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細胞解離出來，常采用的方法如下：

一、懸浮細胞的分離方法

 組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，Z簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當延長離心時間，但速度不能太高，延時也不能太長，以避免擠壓或機械損傷細胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當細胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細胞，常采用離心后的細胞分層液，因為，經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞 ．

二、實體組織材料的分離方法

（一）機械分散法

  所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分

散組織細胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細胞通過針頭

壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此

法分離細胞雖然簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。此法僅適

用于處理纖維成分少的軟組織。

（二）消化分離法

1、酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：

（１）胰蛋白酶分散技術(shù)  

    胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開．胰蛋白酶對細胞的作用，取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。

 ①細胞類型  胰蛋白酶適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織,如  乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效．

 ②酶的濃度  胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250)．

分離方法如下：

 ①過夜冷消化  將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細胞計數(shù)，按適當?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

（２）膠原酶（Collagenase）消化法

適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用．可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細胞成活率，Z終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。

2、非酶消化法（EDTA消化法）

 常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散． 

消化分離法的操作步驟：

（1）剪切  把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。

（２）加液漂洗  將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。

（3）消化  加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當時間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。

（4）棄去消化液  采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。

（5）漂洗  將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培養(yǎng)基。

（6）機械分散  采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細胞懸液進行分瓶培養(yǎng)。